在正相色譜中,一般采用極性鍵合固定相,硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán),鍵合相的名稱由鍵合上去的基團(tuán)而定。常用的有氰基(-CN)、氨基(-NH2)、二醇基(DIOL)鍵合相。流動(dòng)相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑,如烴類溶劑,或其中加入一定量的極性溶劑(如氯仿、醇、乙腈等),以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。組分的分配比K值,隨其極性的增加而增大,但隨流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大(或濃度增大)而降低。同時(shí),極性鍵合相的極性越大,組分的保留值越大。該法主要用于分離異構(gòu)體,極性不同的化合物,特別是用來分離不同類型的化合物。
在反相色譜中,一般采用非極性鍵合固定相,如硅膠-C18H37(簡(jiǎn)稱ODS或C18)硅膠-苯基等,用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相,如甲醇/水,乙腈/水,水和無機(jī)鹽的緩沖液等。
正相色譜和反相色譜的區(qū)別:
本質(zhì)上是填料(固定相)的不同,正相色譜柱填料極性強(qiáng),洗脫順序由弱到強(qiáng);反相色譜柱填料極性弱,洗脫順序由強(qiáng)到弱。
1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán),如(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN,CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng),因此,分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小,即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低,如正已烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
2、反相色譜
反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì),表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng),通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最先被沖洗出,而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。